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        TOPO Cloning Kit

        ——2017-11-09

        TOPO Cloning Kit

         

        GT1505-20T  GV TOPO-TA-Amp Cloning Kit适用于Taq DNA聚合酶扩增的末端加“A”的PCR片段的快速克隆

        GT1503-20T  GV TOPO-Blunt-Amp Cloning Kit适用于Pfu、KOD等高保真聚合酶扩增的平末端的PCR片段的快速克隆

        产品规格:20T

        保存与运输:-20℃。

         

        一、产品特点

        1、连接只需5 min。

        2、载体不含LacZ基因,无需蓝白斑筛选。

        3、优质PCR产物(无非特异性条带、无引物二聚体)可直接进行克隆,无需纯化。

         

        二、PCR产物的制备:

        1、扩增引物不能磷酸化。

        2、PCR反应结束后,电泳检测PCR产物产量和质量,若有非特异性扩增或引物二聚体,则需切胶回收目的条带后进行克隆。

         

        三、操作步骤

        克隆反应:

        1、室温下,按下表配制反应体系:

        试剂

        添加量

        DNA片段

        0.5-8 μl

        TOPO cloning vector

        1 μl

        10×TOPO Buffer

        1 μl

        ddH2O

        x μl

           连接反应体系的总体积为10μl(用ddH2O补足)。轻弹离心管将反应体系混匀,短暂离心3-5s。

           注:整个操作过程均在室温条件下进行,切勿在冰上操作。

           如果PCR产物电泳检测仅有很亮的目的条带,无非特异性条带和引物二聚体,可取0.5-1μlPCR产物原液直接进行克隆

        2、将离心管于室温(22-30℃)下静置0-5 min(不可超过5 min)。反应结束后将离心管放置在冰上,进行后续的转化操作。

                 注:室温下(22-30℃)反应时间不可超过5 min,时间过长克隆效率会下降。若室温较 低,建议使用PCR仪控温,可设置25℃反应5min。若连接产物未能立即用于转化,需保存于-20℃。不建议对连接产物做长期保存。

        3、阳性对照实验:

        1μl试剂盒提供的对照片段进行克隆、转化后,将菌液涂布在含有相应抗生素的培养平板上,37℃培养过夜。取菌斑进行PCR扩增。

        附:不同长度的DNA片段的最适添加量参照表:

        DNA片段大?。?/SPAN>bp

        最适添加量(ng

        100-1000

        20-50

        1000-2000

        50-100

        2000-5000

        100-200

        转化(此操作需在无菌条件下进行):

         

        1、取5 μl连接产物加入到50-100 μl 刚刚融化的感受态细胞中(感受态细胞应刚从-80℃取出,于冰上融化,刚刚融化便加入连接产物),温和混匀,冰浴2-30 min。

        2、42℃水浴热激30s。(勿晃动离心管)

        3、立即转移到冰上,静置2 min(冰浴期间勿晃动离心管)。

        4、加入300-500 μl LB培养基(不含抗生素),37℃,200-250 rpm振荡培养60 min。

        注:当插入片段的长度<2 kb时,可省略复苏步骤(步骤4),直接将转化后的菌液涂布在含氨苄青霉素的平板上,37℃培养过夜。

        5、取200 ul菌液,涂布于含氨苄青霉素的平板上,37℃培养过夜。

        注:若想获得更多克隆,可将菌液低速(3000 g)离心2 min,弃掉部分上清液,用移液器吹打至菌体完全重悬,吸取全部菌液涂布于含氨苄青霉素的平板上,37℃培养过夜。

         

        检测:

        1、菌落PCR法(无菌操作):

        1)挑选单菌落至10 μl无菌水中,充分混匀。

        2)取2 μl菌液作为PCR反应的模板,用试剂盒提供的M13F/M13R引物扩增插入片段。

        3PCR反应条件

             94  2 min

             94  30 sec

             56  30 sec    30 cycles

             72  1 kb/min  (根据片段大小确定延伸时间)

             72  10 min

        4)电泳检测PCR产物,若载体自连,则扩增出的片段大小为143 bp。

        5)确定重组子后将剩余的8 μl菌液转接到LB培养基中(含相应的抗生素),摇菌培养过夜,然后提取质粒进行测序。

        2、限制性酶切法:

        1)挑取单克隆至LB培养基中(含相应抗生素),过夜摇菌,抽提质粒。

        2)用EcoRI/EcoRV/PstI或合适的限制性内切酶,对质粒进行酶切,鉴定重组子。

         

        测序:

            用M13FM13R通用引物测序,然后进行序列分析。

               M13F5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3

               M13R5-CAGGAAACAGCTATGACC-3

         

        四、常见问题分析:

        重组子克隆菌少,或阳性率低:

        1、感受态效率低:使用转化效率>5×107fcu/μg的感受态细胞;

        2、连接反应在低温下(如碎冰上)操作:应在室温下操作;

        3、连接反应时间过长:室温下放置5min即可,时间过长效率会下降;

        4、PCR产物加入量太少或太多:按照推荐量加入;

        5、PCR产物纯度低:重新扩增或重新纯化PCR产物;

        6、PCR产物质量低,切胶十紫外照射时间长:使用蓝光切胶仪切胶或加快切胶速度,减少PCR产物在紫外下暴露的时间;

        7、转化后没有做复苏:可加入LB培养基(无抗生素)震荡培养60min;

        8、克隆基因可能对宿主菌有毒性,比如某些编码膜蛋白和DNA结合蛋白的基因,某些启动子和调节序列基因,或含有倒置或串联重复序列的基因:选用室温过夜培养平板。

         

        附:载体图谱


         


         

         

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